Ο ναός της Αγίας Βαρβάρας βρίσκεται κοντά στη Μεγάλη Παναγία του Ρεθύμνου και εορτάζει στις 4 Δεκεμβρίου. Ο ναός ιδρύθηκε το 1885 στη θέση παλαιότερου ναού, πιθανότατα αφιερωμένου στην ίδια αγία, που εμφανίζεται σε χάρτες του 1613. Ο σημερινός ναός ανήκει στον αρχιτεκτονικό τύπο του ελεύθερου σταυρού με τρούλο με γοτθικά στοιχεία. Στο εσωτερικό υπάρχει επιβλητικός πολυέλαιος, αφιέρωμα των Ρωσικού στρατού που χρησιμοποίησε το ναό κατά τη Ρωσική διοίκηση του Ρεθύμνου το διάστημα 1898 έως 1907.
Λόγω της διασύνδεσης του ναού με διάφορες θαυματουργικές επεμβάσεις για τη σωτηρία της πόλης και των κατοίκων της κατά την περίοδο της Τουρκοκρατίας, η Αγία Βαρβάρα αποτελεί την πολιούχο της πόλης του Ρεθύμνου. Ακόμη και η ίδρυση του ναού συνδέεται με θαύμα και με τον τρόπο που οι Χριστιανοί το 1883 έπεισαν τον Τούρκο Αλή Εφέντη Τσιτσεκάκι που είχε μετρατρέψει τον ερειπωμένο ναό σε λουτρό, να μην προχωρήσει σε προγραμματισμένη κατεδάφιση του εναπομείναντος ναού, και να τους τον παραχωρήσει για την ανέγερση νέου ναού. Αφού αρχικά ο Τούρκος αγάς δεν έδινε τη συγκατάθεσή του, σύμφωνα με την λαϊκή παράδοση, επιδημία ευλογιάς κατέκλυσε τις μουσουλμανικές οικογένειες του Ρεθύμνου, ενώ οι χριστιανικές παρέμεναν υγιείς. Τότε οι μουσουλμάνοι, θεωρώντας ότι η επιδημία προκλήθηκε από την Αγία Βαρβάρα, πίεσαν τον αγά να παραδώσει το συγκρότημα του ναού στη χριστιανική κοινότητα, όπως κι έγινε το 1885.